（1）实验原理

本实验的实验原理和知识点覆盖了《细胞生物学》、《分子生物学》、《生物化学》、《有机化学》等多门本科生课程。

1）差速离心法提取外泌体实验原理 

   其核心原理为沉降平衡方程，当两个或多个颗粒的直径有显著差异时，其离心沉降速度也将会有较明显差别。直径大的颗粒很快就可以沉淀下来，而更小的颗粒需要更大的离心力或者更长的离心时间才可完成沉降。超速离心法，正是通过大小和密度两个不同的维度，根据实验的需要，一步步地把我们所要重点研究的外泌体颗粒，从纷繁复杂的体液环境中、从不同的胞外囊泡中分离、富集和纯化下来。 

2）动态光散射检测外泌体粒径实验原理 

   粒子的布朗运动导致光强的波动，微小粒子悬浮在液体中会无规则地运动。布朗运动的速度依赖于粒子的大小和媒体粘度，粒子越小，媒体粘度越小，布朗运动越快。通过光强波动变化和光强相关函数计算出粒径及其分布。 

3）Western blot检测外泌体标志蛋白实验原理

   Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

 4）叶酸修饰外泌体实验原理 

   肿瘤细胞和正常细胞在细胞表面受体的表达上有着很多差异，在肿瘤细胞表面往往会存在一系列过度表达的特异性受体，这类特异性受体在肿瘤细胞膜表面高度表达，但在正常细胞膜表面表达很少，因此我们可以根据肿瘤细胞的这种特点，通过合适的靶头与其表面过度表达的受体进行特异性结合，达到肿瘤细胞靶向给药的目的。叶酸受体α (Folate receptora，FRa）是一种含糖基磷脂酰肌醇的单链糖蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇固定在细胞膜表面，FRa可以高度亲和叶酸，并将叶酸转运到细胞内利用，而叶酸对于细胞内的合成代谢有着广泛的作用。叶酸受体在正常细胞表面通常表达较少，但在某些肿瘤细胞包括肺肿瘤细胞表面过度表达其表达水平往往伴随肿瘤的进展而升高，因此叶酸受体被广泛用于诊断和治疗相关肿瘤的靶点。

 

知识点：共11 个

    1. 外泌体的认识

    2. 肺肿瘤细胞A549的复苏

    3. 肺肿瘤细胞A549的传代

    4. 肺肿瘤细胞A549的冻存

    5. 肺肿瘤细胞外泌体的分离提取

    6. 透射电镜观察肺肿瘤细胞外泌形貌特征

    7. 纳米颗粒跟踪分析仪测定外泌体粒径大小

    8. Western Blot测定外泌体标志蛋白表达情况

    9. 肿瘤细胞和正常细胞在细胞表面受体表达的差异

    10. 叶酸及叶酸受体α的认识

    11. Exo-FA的构建

（2）核心要素仿真设计（对系统或对象的仿真模型体现的客观结构、功能及其运动规律的实验场景进行如实描述，限500字以内）

  本实验的的核心要素包括：细胞复苏冻存及传代，外泌体的分离，对于提取的外泌体进行形态、粒径及标志蛋白的鉴定，对外泌体进行修饰。各要素仿真度如下：

1）细胞复苏冻存及传代

  该要素模拟细胞培养室中对于细胞的复苏冻存传代的模拟操作。内容包括细胞的复苏、细胞的冻存、细胞的传代等实验过程。该部分仿真让学生有机会多次重复亲历细胞培养室的实际操作，实现“以虚代实”，与实验教学无缝对接。

2）外泌体的分离

  该要素模拟了从细胞上清中对外泌体进行提取，形象地仿真了差速超速离心取外泌体的全过程。该部分的仿真不仅突破了实体实验时空尺度大、实验周期长的教学瓶颈，并且锻炼了学生实际动手操作能力，同时让学生体验了差速超速离心的成就感和乐趣。

3）对于提取的外泌体进行形态、粒径及标志蛋白的鉴定

  该要素构建了不同的实验仪器对外泌体进行表征，将透射电镜、Zetaview、Westren Blot相关仪器进行模拟，使学生能将理论知识应用于实践，对于仪器的操作有了更深的认识，以虚拟仿真的仪器为载体，拓展了实验教学的深度和广度

4）对外泌体进行修饰

  该要素模拟了对于外泌体微观表面小分子的修饰。